细胞培养液的配制

关于细胞培养液的配制

培养基的选择

依据:经验、文献、尝试常用:RPMI1640、DMEM

培养基的来源

市售干粉培养基---自己配制液体培养基---直接使用(注意有效期)

第2页,共27页，2024年2月25日，星期天培养基的除菌方法

过滤除菌:(1)正压过滤---效率高

(2)负压过滤---效率低高压蒸气灭菌:

不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加

按使用说明或实验要求添加配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等临用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等

第3页,共27页，2024年2月25日，星期天RPMI1640培养液配制过程

准备物品

(1)不锈钢过滤器,滤膜(0.45μm,0.22μm),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶

(2)培养粉,1NHCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水

消毒物品

滤器中放置0.45μm和0.22μm滤膜,包装,高压蒸气消毒第4页,共27页，2024年2月25日，星期天配制步骤

(1)10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中,磁力搅拌20min(2)加2gNaHCO3/L,继续搅拌10min(3)加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)

链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl约3mL,调pH至7.2,继续搅拌第5页,共27页，2024年2月25日，星期天(5)按要求加血清（血清一般需经56℃，30min灭活）例如:10%胎牛血清无血清培养液900ml

灭活胎牛血清100ml(6)正压过滤除菌(气压适当,防止滤膜破裂)(7)分装,贮存于4℃，2周内用完。(8)无菌试验:取样,37℃放置24－72h,无细菌、霉菌污染方可使用第6页,共27页，2024年2月25日，星期天注意事项

谷氨酰胺在溶液中很不稳定，４℃，７ｄ分解５０％，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，终浓度1－4mmol/L抗生素在37℃稳定性维持3－4d,可控制轻度污染。防污染重在无菌操作

第7页,共27页，2024年2月25日，星期天

培养液配制过程

（以RPMI1640为例）第8页,共27页，2024年2月25日，星期天1.物品准备(1）滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。

第9页,共27页，2024年2月25日，星期天(2)培养粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水第10页,共27页，2024年2月25日，星期天

2.滤器消毒准备第11页,共27页，2024年2月25日，星期天取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中

第12页,共27页，2024年2月25日，星期天将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上第13页,共27页，2024年2月25日，星期天将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒第14页,共27页，2024年2月25日，星期天

3.液体配制第15页,共27页，2024年2月25日，星期天①将培养粉倒入容器中第16页,共27页，2024年2月25日，星期天②加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌第17页,共27页，2024年2月25日，星期天③按照实验的具体要求分别加入NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)第18页,共27页，2024年2月25日，星期天④按要求加入一定比例的血清（血清一般需经56℃，30min灭活）例如:配制含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1升，应加入无血清培养液900ml

灭活胎牛血清100ml第19页,共27页，2024年2月25日，星期天⑤加入1NHCl约3mL,调整pH至7.2－7.4

第20页,共27页，2024年2月25日，星期天磁力搅拌器充分搅拌准备过滤第21页,共27页，2024年2月25日，星期天⑥无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。(一般使用氧气。注意气压适当,防止滤膜破裂，)第22页,共27页，2024年2月25日，星期天将液体倒入无菌滤器，接通气体第23页,共27页，2024年2月25日，星期天

⑦过滤后的液体分装于贮液瓶第24页,共27页，2024年2月25日，星期天分装过程严格无菌操作第