2016上半年分生基因诊断年

1、黄春洪 教授Depart. Biochemistry, Nanchang university基因诊断周小霖：我不想跳舞浙江富阳HD家系图亨廷顿舞蹈病以慢性进行性舞蹈样动作、认知障碍和精神行为异常三联征为典型特点李光坤（外公）王水鹅妹，60亡林关玉45岁病李宝月妈 44亡周小霖 27岁病王光茂45岁亡王大清40岁病儿，读高中王福清30岁病王？45岁亡王世平弟，未发病王美月姐，50亡家系中23人犯病，9人死亡，6人处在发病中1、What gene diagnosis利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。狭义:在基因水平，用PCR、核

2、酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异、表达状态及外源基因插入等，对疾病作出诊断。2、why gene diagonsis 、问、望、听、触 经验型判断的方法。、化验/检验细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。、影像学X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、特殊检查染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。常规诊断的共同问题：不可预先诊断!在第18届国际遗传学大会上，全世界3000名科学家对人类的生老病死做了新诠释“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究病因”。除此之外，人类正常的发育、

3、衰老和死亡，当然也受基因的调控。表型诊断与基因诊断表型诊断（传统方法）基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常分类临床诊断（病因、病解、病生）血清生化检测、影像DNA诊断，RNA诊断 特异性表型改变在很多情况下是非特异性的，往往难以明确诊断延误病情?以探测基因为目标，只要有特异性探针，利用分子杂交原理即可 诊断，具有很高的特异性。灵敏度探针可用“放标”或非放诊断灵敏度高，DNA Pg级早期诊断表型改变发生较晚，难以早期诊断表型改变之前，基因就发生变异，可以早期诊断基因诊断的特征：1 不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2 症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如H

4、untingtong舞蹈病3 产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量。如唐氏筛查基因诊断与诊断学 基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章，从这个意义上来说：基因诊断遵循诊断学的基本原则。 基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表达异常），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。Where & When gene diagnosis1.检测病原微生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.诊断先天遗传性疾患，产前诊断优生学3.检测后天基因突变引起

5、的疾病，如肿瘤。4.其他如亲子鉴定、个体识别、法医物证。国外遗传病检测的项目 常染色体显性遗传病 诊断性遗传检测基因 软骨发育不全症 FGFR3Marfan综合征FBN1Charcot-Marie-Tooth神经病 PMP22,EGR2,MPZ,NEFL,MTMR2 先天性心脏病(LQTS),各型 KCNQ1,KCNH2,SCN5A,KCNE1神经纤维瘤(1型, 2型) NF1,NF2多囊肾(1型, 2型) PKD1,PKD2结节性硬化(1型, 2型) TSC1,TSC2遗传性高胆固醇血症 LDLR 染色体隐性遗传病 诊断性遗传检测基因 囊性纤维化症 CFTR先天性神经性耳聋(SNHL), G

6、JB2,GJB3,SLC26A4先天性心脏病(LQTS) KCNQ1, KCNE1地中海贫血症, B型HBB(血红蛋白B链)白化症 OCA1苯丙酮尿症 PAH脊柱肌萎缩症 SMN1 肝豆状核变性(Wilson)病 ATP7B多囊肾 PKHD1,PKHDL1 X-连锁隐性遗传病 诊断性遗传检测基因 杜兴肌营养不良症 DMDRett综合征 MECP2血友病(A型, B型) F8,F9白化症 OA1G-6-PD缺乏症 G6PD X-连锁显性遗传病遗传性肾病(Alport syndrome) COL4A5 Y-连锁遗传病无精症或少精症 DAZ How:基因诊断策略与方法间接诊断策略遗传标记：RFLP，

7、STR，SNP直接诊断策略PCR，测序，杂交，基因芯片1. RFLP(限制性酶切长度多态）Restriction fragment length polymorphism基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。-GAATTC-GAATTT-GAATTC-CTTAAG-CTTAAA-CTTAAG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAGAATTC-GAATTT-G G-CTTAAA-CTTAAAATTC-G G-CTTA

8、AEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI流程：1.收集足够的病例（或家系）和健康对照组。2.提取DNA或RNA3.PCR扩增4.RFLP酶切5.电泳分析6.确定鉴定条带或基因型。镰刀红细胞贫血 Hb-链N端第6氨基酸Glu（极性）变为Val（非极性），Hb溶解度下降，在氧分压低的毛细血管区，血细胞收缩成镰状。 镰变后红细胞变粘稠，容易堵塞毛细血管，压迫末梢神经，引起大腿和臀部疼痛感。HbS鉴定 限制性内切酶Mst切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb 珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了Mst的位点，便形成1.3kb

9、珠蛋白的DNA片段。 STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是2bp-8bp的串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个，主要形式为：(CA)n ， (GA)n ，(CAG)n ， (CAA)n， (CGG)n 。约30-60kb就存在一个STR，不同个体STR拷贝数相差悬殊，导致其形成高度的遗传多态性。除了同卵双生子，个体间STR均不同。 1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。人类23对染色体，大约7901个STR。2、短串联重复序列(short tendem repeats, STRs）或微卫星（mini-satellite

10、s )或VNTR。身份鉴定方案：PCR扩增，电泳分析PCR产物的长度。 判断：A、B、C哪二者亲缘关系最近？个体间STR拷贝数变异不改变STR及两翼的碱基组成，所以只要核心序列一致，就可以利用限制性内切酶进行剪切，形成不同长度的片段。因此也可以利用Southern杂交作图。DNA指纹（DNA fingerprinting) :法医上亲子鉴定，刑侦。 二、三核苷酸重复序列会出现非特异性PCR产物三核苷酸重复序列与疾病有关四核苷酸重复序列位点比二、三核苷酸重复序列的等位基因更容易彼此区分法医上使用四核苷酸重复鉴定法医亲子鉴定 ( AATG ) 5-115169 bp*6173 bp7177 bp8

11、181 bp9185 bp10189 bp11193 bp等位基因:*AmpFlSTRTH01位点13 核心 STR 位点FGAVWATH01D21S11TPOXCSFD3S1358D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51在法医学上的应用（案件类型）刑事案件的鉴定 （凶杀案、强奸案、拐卖儿童案、碎尸案、抢劫案）民事案件的鉴定（亲权纠纷、移民案、婴儿错抱案、石蜡包埋组织块调错案、超生与否的鉴定）其它：骨髓移植成功与否的鉴定强奸致孕案（血痕检材）强奸致孕案（血液、羊水检材） 受害人(孕妇) 胎儿羊水 嫌疑人(父?) D3S1358 16，16 16，

12、16 16，17VWA 17，18 16，17 16，16 FGA 20，24 23，24 19，23 D8S1179 14，14 13，14 13，16 D21S11 28，30 29.2 , 30 29.2，29.2 D18S51 17，21 13，17 12 ，13D5S818 10，10 10，11 9，11D13S317 8，11 8， 9 9，10D7S820 12，12 8 ，12 8，10D16S539 9，12 10，12 10，11THO1 9，9 6 ，9 6 ， 8TPOX 9，11 8 ，9 8 ，8CSF1PO 11，12 12，13 10，13母亲生育年龄21三体

13、综合征发病率45岁1/50母亲生育年龄与21三体综合征发病率之间的关系位点 长度范围bp11： 184-2361432: 154-1841413: 172-2001414: 255-2851446: 161-1871437: 102-1322039: 219-2511270: 213-2451411: 236-2721412: 383-419D21S21染色体10个STR位点出现1:1:1条带或2:1条带亨廷顿舞蹈症的产前诊断 III3：先证者母亲，IV1症状前患者，条带244bp（48次），IV2：胎儿母亲，IV3：家系中正常对照，IV4：先证者，异常条带298bp（66次）， V1：胎儿，

14、异常条带307bp（n= 次）。IT15 基因第一外显子包含 CAG 重复序列，正常人小于 35 次，编码由 3144个氨基酸组成的正常亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt).（CAG）n n37进行性肌营养不良：渐冰人多重PCR法1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子定义：不同个体间，基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。为基因组变异中最多的一种,在DNA多态性中占90%，其最低的等位基因频率需大于或等于1。 1996年，Lan

15、der报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。（3）单核苷酸多态性single nucleotide polymorphisms, SNP第三代遗传标记单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体A个体B个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90%。目前已知基因组中

16、含有150万个SNP。分布密度高NQO1 rs1800566TT型CC型CT型依赖还原型辅酶I/醌氧化还原酶（NQO1）是两个电子的还原酶，能够还原内源性和外源性的醌类。SNP的意义在于：、致病SNP、疾病易感性SNP、具有诊断价值的SNP、疾病的SNP谱、人表型相关SNP、药物作用与不良反应的SNP目前SNP研究的两个热点：、cDNA上的SNP（cSNP）、启动子上的SNP其他方法Southern blotGene chipASO（等位基因特异性寡核苷酸杂交）PCR-SSCP单链构象多态性DHPLC（变性高效液相色谱）3. 等位基因特异寡核苷酸分子杂交(allele specific oli

17、gonucleotide, ASO)4.单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP） 指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此可检测DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。PCR-SSCP过程： - primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常； 结果分析 2、4、5纯合患者 3. 为杂合子 . 解链构象不同突变DNA原 理正常DNA突变DNA变性高效液相色谱 DHPLCPKU患者饮食禁忌？！思考题：案例：周某，女，南昌县莲塘镇