人类染色体标本的制备及G显带核型分析 ppt课件

1、 人类染色体标本的制备及G显带核型分析安徽医科大学根底医学院生物学教研室安徽医科大学根底医学院生物学教研室 目的和要求目的和要求 1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。2. 熟习人类外周血淋巴细胞的培育方法及G显带 染色体的核型分析技术。 实验原理实验原理 染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分裂期。用于人类染色体标本制备的资料可为骨髓细胞、外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简便的就是抽取少量外周静脉血进展短期培育，经秋水仙素处置秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的聚集，使纺锤体不能构成，从而使有丝分裂停滞在中期时相，此时染色体具有最典型的外形，再经低渗、固定等处置，获得更

2、多的中期分裂相以用于核型分析。n染色体的带纹是染色体标本经过特殊处置后，每条染色体的带纹是染色体标本经过特殊处置后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体的特征。染色体G G显带是多种显带技术中的一种，是显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处置后再用吉姆萨将染色体标本经胰蛋白酶处置后再用吉姆萨GiemsaGiemsa染液染色。染液染色。G G显带技术因其方法简便，反显带技术因其方法简便，反复性好，带纹明晰且可长期保管而运

3、用最为广泛。复性好，带纹明晰且可长期保管而运用最为广泛。n核型是指一个体细胞有丝分裂中期的一切染色体，核型是指一个体细胞有丝分裂中期的一切染色体，并按其大小、外形特征顺序陈列所构成的图像。每并按其大小、外形特征顺序陈列所构成的图像。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n2n表示。表示。n染色体核型分析是细胞遗传学的重要研讨手段，在染色体核型分析是细胞遗传学的重要研讨手段，在临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断及研讨中具有重要意义。及研讨中具有重要意义。组组 染色体号染色体号 主要特征主要特征A组组B组组 C

4、组组D组组E组组F组组G组组 123亚中着丝粒染色体亚中着丝粒染色体中央着丝粒染色体中央着丝粒染色体4 5亚中着丝粒染色体、无随体亚中着丝粒染色体、无随体6 12、X亚中着丝粒染色体亚中着丝粒染色体大大小小13 15近端着丝粒染色体、有随体近端着丝粒染色体、有随体161718亚中着丝粒染色体亚中着丝粒染色体中央着丝粒染色体中央着丝粒染色体19 20中央着丝粒染色体中央着丝粒染色体21 22、Y近端着丝粒染色体、有随体近端着丝粒染色体、有随体Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体染色体略大、长臂平行伸展、无随体显带染色体：显带染色体：pq321123464321 52131212123 541213

5、24正常男性：正常男性：46，XY正常女性：正常女性：46，XX正常人体细胞染色体带型方式图正常人体细胞染色体带型方式图 实验用品实验用品 n1器具：采血器具、超净义务台、培育瓶、恒温n 培育箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低n 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学n 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。n2资料：人外周静脉血。n3试剂：RPMI-1640培育液、小牛血清、肝素、植n 物血凝素PHA、秋水仙素(20g/ml)、n 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、n 固定液甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用、n Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓

6、冲n 液。 实验步骤实验步骤 n( (一一) )人类外周血染色体标本的制备人类外周血染色体标本的制备n1 1采集人外周静脉血采集人外周静脉血1ml1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。，迅速与适量肝素混匀抗凝。n2. 2. 超净义务台内将抗凝血参与超净义务台内将抗凝血参与RPMI-1640RPMI-1640培育液中，培育液中，每每n 瓶加瓶加0.30.30.5 ml0.5 ml全血。悄然混匀。全血。悄然混匀。n3. 373. 37恒温培育箱静置培育恒温培育箱静置培育72 h72 h左右培育左右培育24 h24 h后后程度程度n 轻摇培育瓶一次，以悬浮混匀血细胞。轻摇培育瓶一次，以悬浮混匀血细胞。n4

7、. 4. 培育至培育至686872 h72 h即终止培育前即终止培育前2 24 h4 h，每瓶，每瓶加秋加秋n 水仙素水仙素(20 g/ml)(20 g/ml)至终浓度至终浓度0.10.10.2 g/ml0.2 g/ml，轻摇轻摇n 培育瓶混匀，继续培育培育瓶混匀，继续培育2 24 h4 h。n5. 5. 终止培育，将培育物吹打混匀后转移到终止培育，将培育物吹打混匀后转移到10 ml10 ml玻璃玻璃离离n 心管，配平，心管，配平，1800 rpm 1800 rpm 离心离心6 min6 min。n6. 6. 低渗低渗 弃上清。参与弃上清。参与3737预温的预温的0.075 mol/L0.07

8、5 mol/L氯化钾氯化钾n 8 ml 8 ml，吸管悄然吹打混匀，吸管悄然吹打混匀，3737低渗处置低渗处置20 min20 min。n7. 7. 预固定预固定 参与参与1ml 1ml 新颖配制的固定液甲醇新颖配制的固定液甲醇: :冰醋酸冰醋酸n =3:1 =3:1，悄然混匀，悄然混匀，1800 rpm 1800 rpm 离心离心6 min6 min。n8. 8. 固定：弃上清，参与上述新颖固定液固定：弃上清，参与上述新颖固定液8 ml8 ml，悄然混，悄然混n 匀，室温下静置固定匀，室温下静置固定20 min20 min。n9. 9. 弃上清，反复固定弃上清，反复固定1 1次。次。n10.

9、10.弃上清，根据沉淀量多少参与适量滴数新颖固定弃上清，根据沉淀量多少参与适量滴数新颖固定n 液，悄然混匀，制成磨砂状悬液。液，悄然混匀，制成磨砂状悬液。n11.11.制片：取上述悬液制片：取上述悬液1 12 2滴，滴至沾有冰水或枯燥的滴，滴至沾有冰水或枯燥的n 干净载玻片上，吹散，过火，空气枯燥。干净载玻片上，吹散，过火，空气枯燥。n12.3712.37温箱放置温箱放置3 34 4天或天或7070烘烤烘烤2 h2 h进展老化处进展老化处n 理，以备显带分析用。理，以备显带分析用。【实验方法和步骤】1、预处置：实验前3-4小时，取安康小鼠，每只腹腔注射001 秋水仙素03-04ml。留意不要伤

10、及内脏。2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用力向后拉断其颈椎。处死后立刻用剪刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股骨，剔除上面的肌肉，洗净。( (二二) )人类染色体的人类染色体的G G显带显带1.1.胰蛋白酶预备：在盛有胰蛋白酶预备：在盛有45 ml 0.85%45 ml 0.85%生理盐水的染生理盐水的染缸缸 中加中加3 ml 0.25%3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调理胰蛋白酶溶液，调理pHpH值至值至6.86.8 7.2 7.2，置，置3737恒温水浴锅中预温。恒温水浴锅中预温。2.2.胰蛋白酶消化处置：将经老化处置的标本片放入胰蛋白酶消化处置：将

11、经老化处置的标本片放入胰蛋胰蛋 白酶溶液中处置白酶溶液中处置2 23 min3 min，不断轻摇载玻片以保，不断轻摇载玻片以保证证 作用均匀充分。作用均匀充分。3.3.漂洗：迅速用漂洗：迅速用0.85%0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶酶 的作用。的作用。4.4.染色：用吉姆萨义务液染色染色：用吉姆萨义务液染色101015 min15 min。5.5.冲洗枯燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气枯燥冲洗枯燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气枯燥或电或电 吹风吹干。吹风吹干。6.6.镜检：光学显微镜下察看分析核型。镜检：光学显微镜下察看分析核型。( (三三) G) G显带的核

12、型分析显带的核型分析1.1.选取染色体分散良好、长度适中染色体选取染色体分散良好、长度适中染色体G G显带核型显带核型 照片，首先进展计数，然后将每条染色体剪下。照片，首先进展计数，然后将每条染色体剪下。2.2.配对：同源染色体外形一样，带型一样；非同源染配对：同源染色体外形一样，带型一样；非同源染色体的大小，外形等带型各异，根据这个原理，按色体的大小，外形等带型各异，根据这个原理，按照染色体的大小、外形、着丝粒的位置，随体的有照染色体的大小、外形、着丝粒的位置，随体的有无和无和G G显带带型等特征将显带带型等特征将4646条染色体配成条染色体配成2323对。对。3.3.染色体陈列：将配成染色

13、体陈列：将配成2323对的染色体按大小次序陈列，对的染色体按大小次序陈列，一对性染色体排在最后，并把陈列好的一对性染色体排在最后，并把陈列好的2323对染色体对染色体分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成 46,XX46,XX或或46,XY46,XY。正常男性染色体正常男性染色体G-显带核型显带核型人类染色体人类染色体G-G-显带特征口诀：显带特征口诀：n一秃二蛇三蝶飘 四鞭炮五黑腰n六号是个小白脸 七上八下九苗条n十号长臂近带好 十一低来十二高n十三四十五

14、 下、中、上n十六q2缢痕大 十七长臂带脚镣n十八人小肚皮大 十九一点腰n二十头重又脚轻 二十一象个葫芦瓢n二十二头带小黑帽 X一担挑，Y是黑脚 本卷须知本卷须知 n1. 1. 染色体标本制备中的关键要素包括秋水仙素的用量染色体标本制备中的关键要素包括秋水仙素的用量和作用时间、低渗和固定的处置。其中低渗时间很重要，和作用时间、低渗和固定的处置。其中低渗时间很重要，处置时间过长那么细胞膜过早破裂导致染色体丧失，处处置时间过长那么细胞膜过早破裂导致染色体丧失，处置时间缺乏那么致染色体分散不好，不利于计数分析。置时间缺乏那么致染色体分散不好，不利于计数分析。n2. G2. G显带过程中的关键要素包括胰蛋白酶的作用时间、显带过程中的关键要素包括胰蛋白酶的作用时间、温度、温度、pHpH等。其中胰蛋白酶溶液应等。其中胰蛋白酶溶液应373