精制牛血清项目可行性报告.doc

34精制牛血清白蛋白项目可行性研究报告项目名称：精制牛血清白蛋白项目建设单位：双城阿普蒂特农业发展有限公司单位负责人：黄世东 联系电话2012年8月8日目 录一、总论3二、项目建设的必要性和优越条件6 1、项目提出的背景和必要性6 2、国家相关的政策支持6三、项目定位和选址81、项目定位8 2、相目选址8四、建设规模与产品方案91、项目建设的目的及指导思想 92、项目建设的总体规模与布局 11 3、工程方案 114、建设周期 115、项目经营思路 11五、项目产品前景展望和项目应用的技术11（一）项目产品介绍11（二）、项目产品在生物工程中的应用13（三）、牛血清的质量要求和制备技术工艺19（四）项目产品前景展望 27六、投资估算及资金筹措 281、投资估算及资金筹措 282、项目收益 283、项目社会效益 284、项目的经济效益 285、风险性分析 29七、结论 30附件：1、项目法人营业执照 34 2、项目法人代码证 35 3、项目法人税务登记证 36 4、建设用地土地使用证 37一、总论：1、项目名称：精制牛血清白蛋白项目2、承办单位概况：双城阿普蒂特农业发展有限公司双城阿普蒂特农业发展有限公司位于国家内陆奶牛养殖区域的核心区域-双城市。地处以哈尔滨为中心的经济圈内，京哈102国道，有国际机场、铁路和高速公路与国内外相联系，交通便捷，物流通畅。 双城阿普蒂特农业发展有限公司是一家专业从事奶牛养殖、生物产品研发、制造、销售的公司。 双城阿普蒂特农业发展有限公司拥有优秀的管理团队和高素质的专业技术人才，成套的现代化生产设备和精密的质量检测仪器，以及按GMP标准设计的净化车间和完善的质量保证体系。 双城阿普蒂特农业发展有限公司采用科学的血清采集方法，先进、稳定的生产工艺，严格的质量检测手段，生产出低内毒素、无噬菌体、无支原体及无其他病毒污染的高品质细胞培养用新生牛血清和在色泽、溶解度、纯度、功能性等方面均较传统产品有较大突破的牛血清白蛋白。双城阿普蒂特农业发展有限公司将长期致力于研发生物医药原辅料，追求持续、稳定的提高产品和服务质量，为您的研究和生产提供更高质量的产品，使您获得更大的成本效益、更好的生产效率和更高的品质保证。3、拟建地点：黑龙江省双城市希勤乡爱兴村4、建设内容与规模：本项目总投资1666万元。其中：固定资产投资1116万元（土建投入：470万元，设备投入480万元，设施投入：166万元）；流动资金550万元。 5、建设周期：项目建设期10个月。6、概算投资：项目计划投资1666万元；7、效益分析：（1）、本项目总投资1666万元。其中：固定资产投资1116万元（土建投入：470万元，设备投入480万元，设施投入：166万元）；流动资金550万元。（2）、项目收益 ：A、年收入：4000万元 B、年利润：2200万元 C、净利润：1671万元D、年利税总额：529万元二、项目建设的必要性和优越条件：1、项目提出的背景和必要性： 我国牛血清行业历经多年的发展，技术水平迅速提高，特别近几年，已经走上了一条快速发展的道路。但目前我国牛血清行业的水平还是处于作坊式生产，无品牌，缺少管理和监管，这与国外发达国家相比相差甚远，特别是在企业管理水平和品牌的创造及维护方面，还存在一定的差距。高端牛血清还依赖进口，价格很高。为此，尽快的提高我国牛血清质量和技术水平，缩小与先进国家牛血清质量的差距，满足国内市场的日益增长的需求，提高牛血清产品质量尤为重要。2、牛血清市场需求广泛牛血清用于细胞培养已超过50年,虽然其污染外源因子的风险不能完全排除,但是至今许多贴壁细胞系和原代细胞还需采用添加牛血清的培养基进行大规模培养。牛血清用途如下：1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率3、项目建设区域内供体小公牛充裕项目建设区域是国内比较大的奶牛养殖区域，奶牛年存栏数近30万头。与项目产品有关的淘汰小公牛内年近10万头，现有小公牛血清分离企业近20家，它们全部是家庭作坊式简单分离和加工，生产车间即简单又简陋。4、国家相关的政策支持： 涉农优惠政策和本地区开发的优惠政策,本市还有专门的扶持政策。 三、项目定位和选址 ：1、项目定位： 本项目利用生物工程技术采用科学的血清采集方法，先进、稳定的生产工艺，严格的质量检测手段，生产出低内毒素、无噬菌体、无支原体及无其他病毒污染的高品质细胞培养用新生牛血清和在色泽、溶解度、纯度、功能性等方面均较传统产品有较大突破的牛血清白蛋白。2、相目选址： 本项目拟建在项目我公司旗下原有的位于黑龙江省双城市所在地黑龙江省双城市希勤乡爱兴村。 （1）、区域综合环境：项目所在地处于双城市的奶牛养殖产业区域，年淘汰小公牛近10万头。十分有利于精制牛血清产业的发展。 （2）、局部环境：厂区远离农户，无污染，空气清新。交通方便，通讯便利。 （3）、周边环境：莅临公司旗下的位于黑龙江省双城市的奶牛养殖区域，原料运输便利，有利于节省生产成本。 四、建设规模与工程方案：1、项目建设的目的及指导思想： 双城阿普蒂特农业发展有限公司计划建成国内最具规模和影响力的动物血清专业制造商之一。公司将按现行GMP（1998版）要求设计和建设的标准血清生产车间2034 m2，其中生产洁净区域面积300m2，实验室100m2，公司计划引进全套的进口生产设备和生产工艺并建立了按GMP要求的管理制度，保证产品质量及质量的稳定性；公司计划购置先进的实验室分析仪器和设立实验室管理制度，严格按现行中华人民共和国药典（2010版）中要求的动物血清及相关生物材料的检测能力和科研技术水平从事安全生产。公司主要产品为系列动物血清、组织培养基、诊断试剂及生物材料产品等,主要用于科研及疫苗企业和诊断试剂企业的生产。公司拥有高素质的员工团队，公司员工全部经过按GMP规范要求的严格培训；公司凭借强大的技术队伍，不断开发新产品，加大对动物血清进一步的深入研究，使我公司动物血清分离和提纯工程技术始终走在动物血清行业前列，成为动物血清行业的风向标！我们视“质量是生命，开发是寿命，信誉是健康”的理念，努力把产品质量做的更好，以快捷的、完善的售后服务成为客户的忠实地合作伙伴，实现与客户在生物技术领域的共同发展。2、项目建设的总体规模与布局： 项目名称：精制牛血清白蛋白项目建设建设性质：新建 建设规模：年产精制牛血清白蛋白20000kg。 建设内容：建立精制牛血清白蛋白生产线；建设2034 m2GMP标准生产车间（其中生产洁净区域面积300 m2，实验室100 m2。）、辅助生产车间、公用工程及配套服务设施。 3、工程方案：（1）建、构筑物的建筑特征、结构及面积方案（平面图、规划图略）结构形式为：框架钢结构层数为：1层，建设2034 m2GMP标准生产车间总面积为：2034 m2。分为初级加工间800 m2、生产洁净区300 m2、实验室100 m2 、包装间160 m2和冷藏库存间674 m2。高度为：6.4米，跨度22.6米，长度是90米。建筑面积(平方米)： 2034m2 用地面积(平方米)： 4800m2 容积率： 0.42 绿化率(%)： 58%（2）、工程估算：1116万元。土建投入：470万元，设备投入480万元，设施投入：166万元。4、建设周期：项目建设期18个月。 5、项目经营思路： 本项目利用生物工程技术采用科学的血清采集方法，先进、稳定的生产工艺，严格的质量检测手段，生产出低内毒素、无噬菌体、无支原体及无其他病毒污染的高品质细胞培养用新生牛血清和在色泽、溶解度、纯度、功能性等方面均较传统产品有较大突破的牛血清白蛋白。以高起点、高技术含量、高附加值、高质量为原则，以科技创新为动力，以适中的价格、稳定的质量，优质的服务为手段，努力扩大国内市场份额，积极开拓海外市场，不断发展壮大。 五、项目产品前景展望和项目应用的技术：（一）、项目产品介绍1、牛血清的结构牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 2、牛血清（BSA）的作用牛血清（BSA）一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37下只能存活1020min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。 3、牛血清（BSA）在内切酶的缓冲液的作用（1）BSA是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附； （2）BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的至于作用机理我不是很清楚，可能是因为它结构中有17个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合； （3）BSA能防止酶吸附到管壁而损失。（二）、牛血清在生物工程中的运用1、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。（1）. 提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。（2）. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。（3）.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。（4）.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。（5）. 起酸碱度缓冲液作用。（6）. 提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。2、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。（1）. 蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素 细胞促进细胞附着；2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促细胞附着；转铁蛋白 能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。（2）.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。（3）.激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素：促细胞增殖效应。氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。（4）.其他成份：氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。3、细胞培养基的几个问题 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 室温下配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？ 缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同PH值 4C 25C 37C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞： 1. 去除培养基。 2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。 3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。 4. 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。） 6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。 7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ 通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫? 这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？ 如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？ 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？ 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？ 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。 保存血清最好的方法? 我们建议血清应保存在-5至-2O。若存放于4时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。 若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。 为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 有必要做热灭活吗? 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量! 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 有些胎牛血清产品没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。 如何避免沉淀物的产生? 我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，非常容易产生沉淀物。 (2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 (3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 (5)若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。（三）、牛血清的质量要求和制备技术工艺1、牛血清质量在细胞培养中的重要性生物技术已经被世界各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位，特别是生命科学的发展更离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。2、牛血清的来源及制备技术工艺随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份牛血清的质量要求也不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。（1）、WHO公布的用动物细胞体外培养生产生物制品规程中的要求：a. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。b.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。c.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。d.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。e.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。f.对细胞有良好的支持繁殖作用。（2）、我国在对牛血清的质量2000年版中国生物制品主要原辅料质控标准中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。（3）、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。1） 血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验结果和交付情况。2）血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛（1014天）和小牛（10个月内）血清静脉取血。血清采集条件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56水浴30分钟灭活。3）血清的制备：a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的球蛋白，使FBS 球蛋白含量减到最低，一般IgG5ug/ml，生物学活性不变。b. 血清透析：用1200014000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶过氧化酶方法测定）。c. 射线照射：已经证明射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为3045KG。而且这个剂量的射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。4）除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米（micron）和0.1微米滤膜。FBS要通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。4.终产品血清质量1）化学检定：渗透压pH蛋白含量电泳法白蛋白 球蛋白 血红蛋白随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。2） 微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。支原体：在支原体专业培养基上培养了34周，培养温度362分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等。病毒检查：牛兰舌病毒 Bovin blue tongue牛腺病毒 Bovine Adenovirus牛细小病毒 Bovine Parvovirus牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus狂犬病病毒 Rabies呼肠弧病毒 Reovirus牛呼吸道合胞病毒 BRSV副流感病毒型 Parainfluenza检查方法：已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液中加15已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光抗体技术进行检查。细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在28和2024进行。阴性对照细胞预先感染副流感型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。3）内毒素检测用鲎试剂检查。4）细菌噬菌体检查主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。5）激素含量测定每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等。6）血红蛋白检测血红蛋白与氧合血红蛋白的比70，血红蛋白含量mg15/dl。7）细胞生长效果测定a.细胞克隆效果测定细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653血清浓度与细胞数:10血清1个细胞孔4血清5个细胞孔细胞培养基RPMI1640， 96孔培养盘362，5二氧化碳培养1015天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。克隆效率计算：克隆效率(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100 相对克隆效率待测血清克隆效率/参考血清克隆效率b.贴壁效率试验：用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549（人肺癌细胞）该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10血清100细胞孔，4血清200介细胞孔。放362，湿润5二氧化碳培养箱培养1014天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。贴壁效率（）(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100相对贴壁效率被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率c. 二倍体纤维细胞促生长试验人二倍体细胞株 WI28 MRc525cm2细胞培养瓶，5血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每代接种二个细胞瓶，362培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待检血清与参考血清的相对生长率（RGR）。RGR(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100牛血清主要质量要求（Sigma） 胎牛血清新生牛血清成牛血清牛龄胎1014天10个月无菌病毒支原体噬菌体内毒素（ng/ml）1.010.010(15)血红蛋白（g%）3.04.53.56.05.08.5pH6.78.07.08.07.08.0渗透压（mom/Kg H2O）240340240340240340 新的药品管理法即将公布，新的药品管理法对生物制品提出更严格的质量要求。特别是我国即将加入WTO，会有更多的国外生物制品进入中国市场，我国的生物制品也希望更多地走向国际市场，所以在制品质量上要求会更高，产品的市场竞争应主要靠质量竞争。所以对产品中的主要原材料的质量要求也会越来越严格。如实验动物我国SDA已提出严格的质量标准，并提出全国各使用部门达到标准的期限。为了贯彻2000年版中国生物制品规程标委会修订了中国生物制品主要原辅材料质控标准其中包括了生产用牛血清的质控要求，这是一个最低要求，和国外产品的要求还有差距，希望各牛血清生产单位和使用单位，自己能制定出更高更严格的标准，以进一步提高我国生物制品质量。（四）、项目产品前景展望及优势1、项目产品前景展望由于牛血清的市场需求广泛，要求质量高，现国内生产企业达到质量要求的产品是少之又少，也可以说高端市场需求的牛血清几乎全部要进口，价格几乎在每千克5000元以上。而国内生产的低端牛血清价格每千克仅在1500元。目前，各种疾病的泛滥，疫苗的需求量正在急剧的上升，而疫苗的生产和实验过程是需要大量的高端牛血清来做辅料和培养基，这样就给原本市场供需不太紧张的高端牛血清市场带来了紧张的供需氛围，使得其价格一路走高，并有将继续走高的趋势。2、牛血清白蛋白（BSA）优势：（1）、本牛血清白蛋白来源于中国黑龙江，中国黑龙江是美国农业部（USDA）认证的无口蹄疫、牛瘟、疯牛病的国家之一。国家对于动物制品的采集和生产有着严格的法律要求。（2）、本BSA计划生产两种，一种为蛋白全组分，一种为蛋白组分FV段，可根据市场需要进行生产；（3）、蛋白质浓度高达100，不含有脂肪酸、牛的IgG和蛋白酶；（4）、产品质量稳定，这是很多BSA生产厂家的BSA所不及之处；（5）、进口产品的质量，国产产品的价格，是体外诊断试剂厂家及各科研院校，免疫学、分子生物学良好的选择。3、BSA的生产规格和市场定价(针对企业客户适用)产品名称规格价格牛血清白蛋白BSA5g20元100g300元1kg2000元4、BSA各指标检测检测项目 规格 实际检测 蛋白质（凯氏定氮法） 96.0%100.0%pH值 6.5-7.26.9水分 5.0%0.5%灰度 3.0%1.1%纯度（电泳） 98.0%98.5%蛋白酶 未检测到 未检测到 内毒素 10 EU/mg10 EU/mg脂肪酸 0.05%0.05%六、投资估算及资金筹措：1、投资估算及资金筹措：本项目总投资1666万元。其中：固定资产投资1116万元（土建投入：470万元，设备投入480万元，设施投入：166万元）；流动资金550万元。项目收益 ：A、年收入：4000万元 B、年利润：2200万元 C、净利润：1671万元D、年利税总额：529万元全部投资资金将由自筹和政府财政支持。2、项目收益： 经营收入：根据本项目生产规模、达产计划、市场销售情况、原辅材料供应等特点，估算本项目各年销售收入、盈利水平、盈利能力如下： 各年销售收入估算表： 系列产品产 品 品 种 规格 产量 单价 （元） 年销售收入（万元） 毛利率%备注 1小牛血清100% 10000 kg2000 400065 不含税价牛血清白蛋白 100% 10000 kg2000年盈利能力 单位：万元 系列产品 产 品 品 种 规格 销售额 生产成本 销售费用 利润备注 1小牛血清100% 4000血清白蛋白100% 合计400014004002200说明：1、该利润测算因销售价是不含税价，故未计算增值税金。年利润应扣除所得税方为净利润。 营业税及附加：项目达产后年年产量可达20000kg，年产值4000万元，可实现增值税26.6万元，所得税71万元，利税总额97.6万元。 3、项目社会效益：项目达产后年可消化淘汰小公牛10万头。进厂务工农民21人，进厂务工农民劳务收入75.6万元,上缴国家增值税金529万元。社会效益比较显著。 4、项目的经济效益： A、年收入：4000万元 B、年利润：2200万元 C、净利润：1671万元D、年利税总额：529万元5、风险性分析： 该项目在生产成本上涨20%，销售价格下降20%（一般风险测算都是以产品成本上涨10%，销售价格下降10%计算）的情况下，产品每公斤仍可盈利1320元，盈利水